ПЦР в медицинской диагностике

1. Метод ПЦР при выявлении ДНК включает три стадии
2. Организация работ по выявлению ДНК методом ПЦР
3. Вследствие этого при проведении работ с использованием метода ПЦР необходимо соблюдать следующие правила

Так, к настоящему времени метод амплификации нуклеиновых кислот (НК) полимеразной цепной реакцией (ПЦР) уже достаточно широко используется в практической медицине как эффективный инструмент лабораторной диагностики.

Метод ПЦР при выявлении ДНК включает три стадии:

На первой стадии при температуре 94°С (или выше) происходит денатурация двойной цепи исследуемой ДНК (стадия денатурации).

На второй стадии два олигонуклеотида-праймера, строго специфичные (гомологичные) к определенным участкам антипараллельных цепей исследуемой ДНК, связываются (образуют гибриды с помощью водородных связей) с этими участками ДНК (стадия отжига).

На третьей стадии при температуре 70-72°С с участием термофильной ДНК-полимеразы и дезоксинуклеозид-5ў-трифосфатов происходит синтез новых цепей ДНК. Инициация синтеза ДНК происходит в местах связывания олигонуклеотидов-праймеров с исследуемой ДНК, матрицей для синтеза служат исходные цепи ДНК (стадия полимеризации).

Таким образом, за цикл, включающий три стадии, происходит удвоение каждой из двух антипараллельных цепей ДНК. При проведении 20 таких циклов теоретически происходит увеличение количества исходной ДНК в миллион и более раз.

Наличие специфического продукта ПЦР (ампликона) в подавляющем большинстве случаев детектируют методом электрофореза в агарозном или полиакриламидном гелях. Специфичность полосы амплифицированной ДНК подтверждается ее положением (размерами) по отношению к маркерным фрагментам и положительному ДНК-контролю. Дополнительные доказательства специфичности ампликона получают методами рестрикционного анализа, гибридизации и прямого секвенирования.

Основным достоинством метода ПЦР является чрезвычайно высокая чувствительность анализа – до 1 копии геномной ДНК возбудителя инфекции в исследуемой пробе в «nested»-варианте ПЦР (с «внутренней» и «внешней» парами олигонуклеотидов-праймеров). Чувствительность выявления ДНК в ПЦР с одной парой праймеров составляет обычно 30-100 копий генома в исследуемой пробе.

Для ПЦР-анализа РНК-содержащих инфекционных агентов (например, ВГС, ВКЭ) предварительно проводят стадию обратной транскрипции – получения ДНК, комплементарной вирусной РНК-матрице, для чего используют специфические праймеры к РНК и фермент – РНК-зависимую ДНК-полимеразу (обратную транскриптазу, ревертазу). Далее ПЦР-анализ проводят по схеме, описанной выше.

Возможности, заложенные в методе ПЦР, позволяют, с одной стороны, достигать максимальной специфичности анализа, т.е. отсутствия перекрестных реакций и способности выявлять ДНК конкретного инфекционного агента в присутствии ДНК других микроорганизмов и ДНК организма-хозяина, а также проводить генотипирование. С другой стороны, соответствующий выбор олигонуклеотидов-праймеров, в основном определяющих специфичность анализа ПЦР, позволяет одновременно выявлять ДНК близкородственных микроорганизмов.

Другим достоинством ПЦР-метода является то, что для ПЦР-диагностики практически всех инфекционных заболеваний может быть использован один набор оборудования, универсальные процедуры подготовки пробы и постановки анализа, а также незначительно отличающиеся (в основном структурой олигонуклеотидов-праймеров) наборы реактивов. К настоящему времени метод автоматизирован и позволяет, при необходимости, получать результаты анализа ПЦР в течение одного рабочего дня.

Высокая чувствительность и специфичность, непосредственное обнаружение инфекционного агента и возможность проведения генотипирования определяют широкую область применения метода ПЦР в клинической диагностике. В настоящее время метод ПЦР используется для:

• ранней диагностики инфекционных заболеваний у серонегативных пациентов, когда лечение наиболее эффективно;
• выявления персистирующих, латентных и рецидивирующих форм инфекций;
• контроля эффективности лечения;
• диагностики оппортунистических инфекций, часто протекающих на фоне иммунодефицита, вследствие чего постановка диагноза только по результатам серологических исследований затруднена из-за имеющихся несоответствий между параметрами иммунного ответа и протекания заболевания;
• разрешения сомнительных результатов серологических исследований;
• эпидемиологических исследований;
• выявления наиболее патогенных штаммов инфекционных агентов;
• исследования инфекционности пулированных образцов крови и ее продуктов, применяемых в терапии;
• определения резистентности к лекарственным препаратам.

Метод ПЦР используется для постановки или подтверждения диагноза, контроля терапии в акушерско-гинекологической практике, неонатологии, педиатрии, урологии, венерологии, нефрологии, гепатологии, пульмонологии, офтальмологии, неврологии, фтизиатрии и др.

Методы ДНК-диагностики незаменимы в пренатальной диагностике наследственных заболеваний (муковисцидоза, фенилкетонурии, гемофилии и пр.), а также при установлении отцовства.

Следует отметить, что широкое использование ДНК-диагностики ни в коей мере не отменяет методы иммунохимических исследований (ИФА, ПИФ, РИФ и др.), а дополняет их. Комплексное обследование пациента различными методами дает возможность врачу-клиницисту получить более полную информацию, как о наличии инфекционного агента, так и об иммунном статусе, что позволяет более точно ставить диагноз, назначать соответствующее этиотропное лечение и вести его последующий контроль.

Организация работ по выявлению ДНК методом ПЦР

В связи с высокой чувствительностью метода ПЦР существует опасность получения ложноположительных результатов в силу переноса через предметы и реагенты как самой ДНК-матрицы, так и продуктов ПЦР – ампликонов, получаемых в больших количествах в течение ежедневной работы. Причинами получения ложноположительных результатов являются три вида контаминаций:

1. Перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложноположительных результатов.
2. Контаминация рекомбинантными плазмидами, содержащими клонированные последовательности детектируемого гена, часто использующимися в качестве положительного контроля.

3. Контаминация продуктами амплификации (ампликонами), являющаяся наиболее частой причиной ложно-положительных результатов, поскольку в процессе ПЦР-генодиагностики ампликоны накапливаются в больших количествах и очень легко переносятся с аэрозолями и через приборы.

Вследствие этого при проведении работ с использованием метода ПЦР необходимо соблюдать следующие правила:

1. Территориально разделять различные стадии анализа ПЦР, размещая их в различных помещениях:
   • помещение для подготовки проб;
   • помещение для постановки ПЦР;
   • помещение для детекции результатов ПЦР.
   Кроме того, подготовку реагентов для выделения НК, проведения ПЦР и детекции результатов ПЦР предпочтительно проводить в отдельном помещении (пре-ПЦР, биохимическая).
2. Для каждой стадии анализа должен быть свой комплект лабораторной одежды, автоматических пипеток, вспомогательных материалов и оборудования.
3. Работу на всех этапах проводить только с использованием одноразовых расходных материалов: пробирок, наконечников для пипеток и пр.
4. Необходима постоянная постановка отрицательных контрольных образцов как на реагенты для подготовки проб (выделение ДНК), так и на реагенты для проведения ПЦР.
5. Работу должен проводить специально обученный персонал, обладающий достаточной квалификацией в данной области.
6. Для контроля чувствительности проводимого ПЦР-анализа необходима постоянная постановка положительных контрольных образцов.

Требования к организации работ в ПЦР-лабораториях обобщены и сформулированы в нормативных документах, на основании которых соответствующие комитеты лицензируют их деятельность:

1. «Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения». 1995, Госсанэпиднадзор.
2. «Требования к планировке помещений и режиму работы в ПЦР-генодиагностической лаборатории». Методические рекомендации, разработаны ЦНИИЭ, РНИПЧИ, ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Эффективный путь в использовании и развитии методов генодиагностики – это создание централизованных ПЦР-лабораторий, оборудованных и организованных в соответствии с необходимыми требованиями и имеющих квалифицированный персонал.

Для получения правильных результатов анализа ПЦР весьма важна организация забора клинических образцов, их хранения и транспортировки. Неправильный забор образцов, некачественное хранение и доставка может привести как к ложноположительным, так и ложноотрицательным результатам, несмотря на безупречно проведенную процедуру анализа.

Забор проб. Для ПЦР анализа используют разнообразный клинический материал: кровь, сыворотку крови, форменные элементы крови, мочу, слюну, соскобы и мазки со слизистых, ликвор, слезную жидкость, содержимое везикул, биоптаты органов и тканей. Для исключения контаминации забор проб производят только одноразовым инструментарием (шприцы, соответствующие зонды, пробоотборники и пр.). Взятый для ПЦР-анализа материал мазка, соскоба помещают в одноразовые пробирки (например, типа «Эппендорф») или тщательно вымытые (хромовой смесью) стеклянные флаконы, а в некоторых случаях в транспортную среду, предоставляемую ПЦР-лабораторией. При необходимости переноса образца используют автоматические микропипетки со сменными одноразовыми наконечниками. Каждый образец для исключения взаимной контаминации хранят и транспортируют в отдельном полиэтиленовом пакете.

Хранение образцов. До транспортировки в ПЦР-лабораторию отобранный биоматериал хранят при температуре 2-4 °С не более 48 ч; для более длительного хранения (до 1 месяца) используют максимально низкую температуру. Необходимо минимизировать время от забора образца до постановки ПЦР-анализа.

Транспортировка образцов.Осуществляется в сумках-холодильниках, термоконтейнерах, термосах с термопакетами, льдом или сухим льдом.

Своевременное выявление этиологических агентов внутриутробных, интранатальных и постнатальных инфекций у новорожденных позволило врачам провести эффективную целенаправленную терапию и значительно снизить тяжелые последствия заболеваний, а также количество летальных исходов. По результатам этих исследований в настоящее время оформляются методические рекомендации по диагностике внутриутробных инфекций методом ПЦР.